Продукти
Комплект за откриване на Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR за 2019-nCoV
Очаквана употреба
Този комплект се използва за качествено откриване на нов коронавирус (2019-nCoV) с помощта на тампони от гърлото, назофарингеални тампони, течност от бронхоалвеоларен лаваж, храчка. Резултатът от откриването на този продукт е само за клинична справка и не трябва да се използва като единствен доказателства за клинична диагноза и лечение. Препоръчва се цялостен анализ на състоянието в комбинация с клиничните прояви на пациента и други лабораторни изследвания.
Принцип на проверка
Комплектът е базиран на едноетапна RT-PCR технология.Всъщност гените ORF1ab и N на новия коронавирус (2019-nCoV) от 2019 г. бяха избрани като целеви региони на амплификация.Специфични праймери и флуоресцентни сонди (N генните сонди са белязани с FAM, а ORF1ab сондите са белязани с HEX) са предназначени за откриване на 2019 нов тип коронавирусна РНК в проби.Комплектът също така включва ендогенна система за откриване на вътрешен контрол (генна сонда за вътрешен контрол, белязана с CY5) за наблюдение на процеса на събиране на проби, РНК и PCR амплификация, като по този начин се намаляват фалшивите отрицателни резултати.
Главни компоненти
| Компоненти | Сила на звука（48T/комплект） |
| RT-PCR реакционен разтвор | 96µl |
| nCOV праймер TaqMan смес от проби（ORF1ab, N ген, RnaseP ген） | 864 ul |
| Отрицателна контрола | 1500µl |
| nCOV Положителна контрола (l ORF1ab N ген) | 1500µl |
Собствени реактиви: реактиви за екстракция на РНК или пречистване.Отрицателна/положителна контрола: Положителната контрола е РНК, съдържаща целевия фрагмент, докато отрицателната контрола е вода без нуклеинова киселина.По време на употреба те трябва да участват в екстракцията и трябва да се считат за заразни.Те трябва да се обработват и изхвърлят в съответствие със съответните разпоредби.
Вътрешният референтен ген е човешкият RnaseP ген.
Условия за съхранение и срок на годност
-20±5℃, избягвайте повторно замразяване и размразяване повече от 5 пъти, валидно за 6 месеца.
Приложим инструмент
С FAM / HEX / CY5 и друг многоканален флуоресцентен PCR инструмент.
Изисквания към образеца
1. Приложими типове проби: тампони от гърло, назофарингеални тампони, течност от бронхоалвеоларен лаваж, храчка.
2. Вземане на проби (асептична техника)
Фарингеален тампон: Избършете сливиците и задната фарингеална стена с два тампона едновременно, след това потопете главата на тампона в епруветка, съдържаща разтвора за вземане на проби
Храчки: След като пациентът има дълбока кашлица, съберете изкашляната храчка в епруветка с капачка на винт, съдържаща разтвора за вземане на проби;течност от бронхоалвеоларен лаваж: Вземане на проби от медицински специалисти.3.Съхранение и транспортиране на пробите
Пробите за изолиране на вируса и тестване на РНК трябва да бъдат тествани възможно най-скоро.Пробите, които могат да бъдат открити в рамките на 24 часа, могат да се съхраняват при 4 ℃;тези, които не могат да бъдат открити в рамките на 24
часове трябва да се съхраняват при -70 ℃ или по-ниски (ако няма условия за съхранение от -70 ℃, те трябва да бъдат
временно съхранявани при -20 ℃ в хладилник).Пробите трябва да избягват повторно замразяване и размразяване по време на транспортиране.Пробите трябва да бъдат изпратени в лабораторията възможно най-скоро след вземането им.Ако пробите трябва да се транспортират на дълги разстояния, се препоръчва съхранение със сух лед.
Методи за изпитване
1 Обработка на проби и екстракция на РНК (зона за обработка на проби)
Препоръчително е да вземете 200 μl течна проба за екстракция на РНК.За свързани стъпки за екстракция вижте инструкциите на търговски комплекти за екстракция на РНК.И отрицателното, и отрицателното
контролите в този комплект са участвали в екстракцията.
2 Подготовка на PCR реагент (зона за подготовка на реагент)
2.1 Отстранете всички компоненти от комплекта и размразете и разбъркайте при стайна температура.Центрофугирайте при 8000 rpm за няколко секунди преди употреба;изчислява се необходимото количество реагенти и реакционната система се приготвя, както е показано в следната таблица:
| Компоненти | N порция (25µl система) |
| nCOV праймер TaqMan смес от проби | 18 µl × N |
| RT-PCR реакционен разтвор | 2 µl × N |
| *N = брой изследвани проби + 1 (отрицателна контрола) + 1 (nCOVположителна контрола) | |
2.2 След старателно смесване на компонентите, центрофугирайте за кратко време, за да оставите цялата течност от стената на епруветката да падне на дъното на епруветката и след това разпределете аликвотна част от 20 µl системата за амплификация в епруветката за PCR.
3 Вземане на проби (зона за подготовка на проби)
Добавете 5 μl от отрицателните и положителните контроли след екстракцията.РНК на пробата, която ще се тества, се добавя към PCR реакционната епруветка.
Затворете плътно епруветката и центрофугирайте при 8000 rpm за няколко секунди, преди да я прехвърлите в зоната за откриване на амплификация.
4 PCR амплификация (усилена област на откриване)
4.1 Поставете реакционната епруветка в клетката за проби на инструмента и задайте параметрите, както следва:
| сцена | Цикъл номер | температура(°C) | време | колекциясайт |
| Обратентранскрипция | 1 | 42 | 10 мин | - |
| Предварителна денатурацияn | 1 | 95 | 1 минута | - |
| Цикъл | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30-те години | събиране на данни |
Избор на канал за откриване на инструмент: Изберете канала FAM、HEX、CY5 за флуоресцентния сигнал.За справка флуоресцентни НЯМА, моля не избирайте ROX.
5 Анализ на резултатите (Моля, вижте експерименталните инструкции на всеки инструмент за настройка)
След реакцията запазете резултатите.След анализа коригирайте началната стойност, крайната стойност и праговата стойност на базовата линия според изображението (потребителят може да коригира според действителната ситуация, началната стойност може да бъде зададена на 3~15, крайната стойност може да бъде зададена на 5~20, корекция) в логаритмичната графика На прага на прозореца праговата линия е в логаритмичната фаза, а кривата на усилване на отрицателната контрола е права линия или под праговата линия).
6 Качествен контрол（Процедурен контрол е включен в теста） Отрицателна контрола: Няма очевидна крива на усилване за FAM, HEX, CY5 канали за откриванеn
COV положителна контрола: очевидна крива на усилване на FAM и HEX канали за откриване, Ct стойност≤32, но без крива на усилване на CY5 канал;
Горните изисквания трябва да бъдат изпълнени едновременно в един и същ експеримент;в противен случай експериментът е невалиден и трябва да се повтори.
7 Определяне на резултатите.
7.1 Ако няма крива на усилване или стойност на Ct> 40 в каналите FAM и HEX на тестовата проба и има крива на усилване в канала CY5, може да се прецени, че няма нов коронавирус 2019 (2019-nCoV) РНК в пробата;
.2 Ако тестовата проба има очевидни криви на амплификация в каналите FAM и HEX и стойността на Ct е ≤40, може да се прецени, че пробата е положителна за новия коронавирус 2019 (2019-nCoV).
7.3 Ако тестовата проба има ясна крива на усилване само в един канал на FAM или HEX и стойността на Ct е ≤40 и няма крива на усилване в другия канал, резултатите трябва да бъдат тествани отново.Ако резултатите от повторния тест са последователни, пробата може да се прецени като положителна за новата
коронавирус 2019 (2019-nCoV).Ако резултатът от повторния тест е отрицателен, може да се прецени, че пробата е отрицателна за нов коронавирус 2019 (2019-nCoV).
Положителна преценка
Методът на ROC кривата се използва за определяне на референтната CT стойност на комплекта, а референтната стойност на вътрешния контрол е 40.
Тълкуване на резултатите от теста
1. Всеки експеримент трябва да бъде тестван за отрицателни и положителни контроли.Резултатите от теста могат да бъдат определени само когато контролите отговарят на изискванията за контрол на качеството
2. Когато каналите за откриване на FAM и HEX са положителни, резултатът от канала CY5 (вътрешен контролен канал) може да е отрицателен поради системна конкуренция.
3. Когато резултатът от вътрешната контрола е отрицателен, ако FAM и HEX каналите за откриване на епруветката също са отрицателни, това означава, че системата е деактивирана или операцията е грешна, t тестът е невалиден.Следователно пробите трябва да бъдат повторно тествани.
