Продукти
Комплект за откриване на SARS-Cov-2-RT-PCR от Lifecosm за 2019-nCoV
Очаквана употреба
Този комплект се използва за качествено откриване на нов коронавирус (2019-nCoV) с помощта на тампони от гърлото, назофарингеални тампони, течност от бронхоалвеоларен лаваж, храчки. Резултатът от откриването на този продукт е само за клинична справка и не трябва да се използва като единствено доказателство за клинична диагноза и лечение. Препоръчва се цялостен анализ на състоянието в комбинация с клиничните прояви на пациента и други лабораторни изследвания.
Принцип на инспекцията
Комплектът е базиран на едноетапна RT-PCR технология. Всъщност, гените ORF1ab и N на новия коронавирус (2019-nCoV) от 2019 г. бяха избрани като целеви региони за амплификация. Специфични праймери и флуоресцентни сонди (N-генните сонди са маркирани с FAM, а ORF1ab сондите са маркирани с HEX) са предназначени за откриване на РНК на нов тип коронавирус от 2019 г. в проби. Комплектът включва и ендогенна система за вътрешно контролно откриване (генна сонда за вътрешно контрол, маркирана с CY5) за наблюдение на процеса на събиране на проби, РНК и PCR амплификация, като по този начин се намаляват фалшиво отрицателните резултати.
Основни компоненти
| Компоненти | Обем(48T/Комплект） |
| RT-PCR реакционен разтвор | 96µl |
| nCOV праймер TaqMan смес от проби（ORF1ab, N ген, RnaseP ген） | 864µl |
| Отрицателен контрол | 1500µl |
| nCOV Положителна контрола (l ORF1ab N ген) | 1500µl |
Собствени реактиви: реактиви за екстракция или пречистване на РНК. Отрицателна/положителна контрола: Положителната контрола е РНК, съдържаща целевия фрагмент, докато отрицателната контрола е вода без нуклеинова киселина. По време на употреба те трябва да участват в екстракцията и да се считат за инфекциозни. С тях трябва да се борави и да се изхвърлят в съответствие със съответните разпоредби.
Вътрешният референтен ген е човешкият ген RnaseP.
Условия за съхранение и срок на годност
-20±5℃, избягвайте многократно замразяване и размразяване повече от 5 пъти, валидно за 6 месеца.
Приложим инструмент
С FAM / HEX / CY5 и друг многоканален флуоресцентен PCR инструмент.
Изисквания за образци
1. Приложими видове проби: тампони от гърлото, назофарингеални тампони, течност от бронхоалвеоларна промивка, храчки.
2. Вземане на проби (асептична техника)
Фарингеален тампон: Почистете сливиците и задната фарингеална стена с два тампона едновременно, след което потопете главата на тампона в епруветка, съдържаща разтвора за вземане на пробата.
Храчки: След като пациентът има дълбока кашлица, съберете изкашляните храчки в епруветка с винтова капачка, съдържаща разтвора за вземане на проби; течност от бронхоалвеоларен лаваж: Вземане на проби от медицински специалисти. 3. Съхранение и транспортиране на пробите
Пробите за изолиране на вируса и РНК тестване трябва да бъдат тествани възможно най-скоро. Пробите, които могат да бъдат открити в рамките на 24 часа, могат да се съхраняват при 4℃; тези, които не могат да бъдат открити в рамките на 24
часовете трябва да се съхраняват при -70℃ или по-ниска температура (ако няма условия за съхранение от -70℃, те трябва да бъдат
временно съхранявани при -20℃ в хладилник). Пробите трябва да се избягват многократно замразяване и размразяване по време на транспортиране. Пробите трябва да бъдат изпратени в лабораторията възможно най-скоро след вземането им. Ако пробите трябва да бъдат транспортирани на дълги разстояния, се препоръчва съхранение в сух лед.
Методи за изпитване
1 Обработка на проби и екстракция на РНК (зона за обработка на проби)
Препоръчително е да се вземат 200 μl течна проба за екстракция на РНК. За свързаните стъпки за екстракция вижте инструкциите на търговските комплекти за екстракция на РНК. Както отрицателният, така и отрицателният
Контролите в този комплект са участвали в екстракцията.
2 Приготвяне на PCR реагент (зона за приготвяне на реагенти)
2.1 Извадете всички компоненти от комплекта, размразете ги и разбъркайте при стайна температура. Центрофугирайте при 8000 оборота в минута за няколко секунди преди употреба; изчислете необходимото количество реактиви и реакционната система се приготвя, както е показано в следната таблица:
| Компоненти | N порция (25µl система) |
| nCOV праймер TaqMan смес от проби | 18 µl × N |
| RT-PCR реакционен разтвор | 2 µl × N |
| *N = брой тествани проби + 1 (отрицателна контрола) + 1 (nCOVположителен контрол) | |
2.2 След като компонентите се смесят старателно, центрофугирайте за кратко време, за да може цялата течност от стената на епруветката да падне на дъното ѝ, след което разпределете аликвотни части от 20 µl амплификационната система в PCR епруветката.
3 Вземане на проби (зона за подготовка на проби)
След екстракцията добавете 5 μl от отрицателните и положителните контроли. РНК на пробата, която ще се тества, се добавя към PCR реакционната епруветка.
Затворете плътно епруветката и я центрофугирайте при 8000 оборота в минута за няколко секунди, преди да я прехвърлите в зоната за амплификация и детекция.
4 PCR амплификация (амплифицирана зона за откриване)
4.1 Поставете реакционната епруветка в клетката за проба на инструмента и задайте следните параметри:
| етап | Цикъл номер | Температура(°C) | Време | колекциясайт |
| Обратнотранскрипция | 1 | 42 | 10 мин. | - |
| Предварителна денатурацияn | 1 | 95 | 1 мин. | - |
| Цикъл | 45 | 95 | 15 секунди | - |
| 60 | 30-те години | събиране на данни |
Избор на канал за детекция на инструмента: Изберете канал FAM, HEX, CY5 за флуоресцентния сигнал. За референтна флуоресценция NONE, моля, не избирайте ROX.
5 Анализ на резултатите (Моля, вижте експерименталните инструкции на всеки инструмент за настройка)
След реакцията, запазете резултатите. След анализа, коригирайте началната стойност, крайната стойност и праговата стойност на базовата линия според изображението (потребителят може да коригира според реалната ситуация, началната стойност може да бъде зададена на 3~15, крайната стойност може да бъде зададена на 5~20) в логаритмичната графика. При прага на прозореца, праговата линия е в логаритмична фаза, а кривата на амплификация на отрицателния контрол е права линия (или под праговата линия).
6. Контрол на качеството (в теста е включен процедурен контрол). Отрицателен контрол: Няма очевидна крива на амплификация за каналите за откриване на FAM, HEX, CY5.
COV положителен контрол: очевидна крива на амплификация на FAM и HEX каналите за детекция, Ct стойност ≤ 32, но няма крива на амплификация на CY5 канала;
Горните изисквания трябва да бъдат изпълнени едновременно в един и същ експеримент; в противен случай експериментът е невалиден и трябва да се повтори.
7 Определяне на резултатите.
7.1 Ако няма крива на амплификация или Ct стойност > 40 в FAM и HEX каналите на тестваната проба и има крива на амплификация в CY5 канала, може да се прецени, че в пробата няма РНК на новия коронавирус от 2019 г. (2019-nCoV);
.2 Ако тестовата проба има ясни криви на амплификация в каналите FAM и HEX и стойността на Ct е ≤40, може да се прецени, че пробата е положителна за новия коронавирус от 2019 г. (2019-nCoV).
7.3 Ако тестовата проба има ясна крива на амплификация само в единия канал на FAM или HEX, а Ct стойността е ≤40, а в другия канал няма крива на амплификация, резултатите трябва да бъдат тествани отново. Ако резултатите от повторното тестване са последователни, пробата може да се счита за положителна за новия тест.
коронавирус 2019 (2019-nCoV). Ако резултатът от повторния тест е отрицателен, може да се прецени, че пробата е отрицателна за новия коронавирус 2019 (2019-nCoV).
Положителна стойност на преценката
Методът на ROC кривата се използва за определяне на референтната CT стойност на комплекта, а референтната стойност на вътрешния контрол е 40.
Интерпретация на резултатите от теста
1. Всеки експеримент трябва да бъде тестван за отрицателни и положителни контроли. Резултатите от теста могат да бъдат определени само когато контролите отговарят на изискванията за контрол на качеството.
2. Когато каналите за откриване FAM и HEX са положителни, резултатът от канала CY5 (канал за вътрешен контрол) може да е отрицателен поради системна конкуренция.
3. Когато резултатът от вътрешния контрол е отрицателен, ако каналите за детекция FAM и HEX на епруветката също са отрицателни, това означава, че системата е деактивирана или операцията е неправилна, т.е. тестът е невалиден. Следователно, пробите трябва да бъдат тествани отново.
